Биомаркеры бронхиальной астмы

Бронхиальная астма (БА) — заболевание, совмещающее в себе несколько синдромов, характеризующееся воспалением, гиперреактивностью и перемежающейся обструкцией дыхательных путей. Спектр клинических проявлений и патогенетических механизмов БА очень широк. В связи с этим подход к методам лечения не может быть стандартизирован и применим в течение продолжительного времени для всех пациентов. Кроме общепринятых способов объективной оценки клинического течения БА (выявление вирусной инфекции и аллергена) существуют недостаточно известные и не всеми применяемые методы. Эти методы направлены на выявление других триггеров обострения заболевания. В большинстве случаев ухудшение при БА связано с усилением воспалительного процесса в дыхательных путях. Следовательно, измерение маркеров этого воспаления позволит четко дифференцировать клинически сходные фенотипы и адекватно откорректировать лечение. Подобное разделение поможет разработать объективную классификацию БА, которую можно будет использовать в проспективных клинических исследованиях.
Вниманию читателя предлагается краткое изложение обзора, опубликованного в журнале Current Opinion in Pulmonary Medicine (январь 2009; 15 (1): 12–18), Anandhi Murugan, Curig Prys-Picard, William J. Calhoun «Biomarkers in asthma». Целью данного обзора является подведение итогов существующей базы данных о биомаркерах БА, выделение главных преимуществ и недостатков каждого подхода, рассмотрение последних достижений в этой области, их анализ и определение направлений дальнейших исследований.

Значение биомаркера или суррогатного маркера возрастает, когда он является более дешевым, менее инвазивным, технически более простым и доступным, чем «золотой стандарт», и обладает мощной биологической достоверностью. «Золотым стандартом» оценки воспаления в дыхательных путях считают биопсию ткани бронха. Это дорогой, инвазивный, сложный в проведении и не всегда доступный для врачей и исследователей метод.

Системные маркеры воспаления в дыхательных путях

Раньше для мониторирования симптомов БА применяли определение количества клеток и протеинов в периферической крови. Данных, подтверждающих ценность этих методов для оценки воспаления в дыхательных путях, очень мало.

Биомаркеры мочи

Цистоинил-лейкотриены мочи были идентифицированы как потенциальный маркер ответной реакции на антагонисты лейкотриеновых рецепторов, особенно у пациентов, не переносящих аспирин [1]. Cai и соавторы сообщают, что у 48 больных БА с хорошим ответом на лечение монтелукастом содержание лейкотриенов в моче (LTE4) было выше, чем у резистентных пациентов (224 и 175 пг/мг соответственно; p < 0,05) [2]. Несмотря на то что эта разница не является статистически значимой, авторы утверждают, что больные с уровнем LTE4 200 пг/мг или выше в 3,5 раза лучше отвечают на лечение монтелукастом, чем те, у кого этот показатель меньше 200. Аналогичная картина наблюдалась в исследовании, проведенном на детях [3], когда при уровне LTE4 100 пг/мг ответ на лечение монтелукастом улучшался в 3,2 раза. Несмотря на результаты этих исследований, определение цистоинил-лейкотриенов в моче не получило широкого распространения.

Оксид азота в выдыхаемом воздухе

После обнаружения в 1991 году связи уровня выдыхаемого оксида азота (ЕNO) с аллергическим воспалением в дыхательных путях [4, 5] это соединение было апробировано в качестве атравматичного биомаркера для оценки воспалительного процесса при БА [6, 7].

Концентрация оксида азота (NO) в выдыхаемом воздухе зависит от скорости потока воздуха, пространственного распределения вентиляции [10] и аксиальной диффузии NO [11]. Для идентификации ЕNO необходимо сделать один выдох с низкой скоростью потока (50 мл/с) и поддержанием положительного давления на выдохе[12]. Правильное выполнение этого приема гарантирует получение достоверного результата. В 2005 году Американское торакальное и Европейское респираторное общества опубликовали рекомендации относительно стандартов выполнения этого теста [13].

Концентрация ЕNO коррелирует с количеством эозинофилов в мокроте, степенью гиперреактивности дыхательных путей, уровнем IgE в плазме крови, результатами кожного прик-теста с аллергенами, симптоматикой БА и легочной функцией [14, 15]. Этот показатель имеет связь с возрастом, ростом, массой тела, полом и расой [16, 17]. В отличие от результатов функциональных исследований он не изменяется в течение дня и нескольких суток, что свидетельствует о высокой воспроизводимости результатов этого теста (внутриклассовый коэффициент корреляции [ВКК] 0,99) [19]. Курение, употребление алкоголя, проведение спирометрии, индукции мокроты и напряжение при выдохе уменьшают концентрацию ENO и, наоборот, присутствие озона или L-аргинина — увеличивает.

Определение ENO — надежный и чувствительный метод для скрининга в целях диагностики нелеченой БА. Чувствительность метода более 20 ppb среди лиц с подозрением диагноза БА составила 88%; при проведении спирометрии и пикфлуометрии — 0–47% с прогностической ценностью отрицательного результата 92% [19]. По результатам исследования European Community Respiratory Health Survey II, чувствительность ENO 18,5 ppb составила 69,2% с прогностической ценностью отрицательного результата 95%, что подтвердило возможность использования метода определения ENO в качестве скринингового [20]. Его с успехом применяют при дифференциальной диагностике хронического кашля, для идентификации гиперреактивности дыхательных путей и кашля при БА [21]. У пациентов с персистирующей БА этот тест используют как дополнительный, так как уровень ENO не коррелирует с тяжестью заболевания [22]. Серийное тестирование помогает при мониторинге активности БА [23, 24], переносимости лечения и ответа на него. Замечено, что повышение концентрации ENO происходит перед снижением пиковой скорости выдоха (ПСВ) [9, 25]. Таким образом, измерение ENO можно использовать для прогнозирования обострений БА [26]. С помощью этого теста можно идентифицировать рецидив при клинической ремиссии [24, 27], что позволит вовремя остановить скрытый воспалительный процесс, который приводит к ремоделированию дыхательных путей и ухудшению легочной функции.

По результатам изучения рентабельности этого теста сообщается об экономии 30–120 евро в год на каждого пациента. В США стоимость одного определения уровня ENO составляет 165 долларов. По итогам недавно проведенного исследования больные, которым своевременно сделали этот тест, в отличие от традиционно леченых групп, принимали ингаляционные кортикостероиды в меньшей дозе без увеличения частоты обострений. Поэтому кажущаяся, на первый взгляд, дороговизна этого метода компенсируется экономией за счет уменьшения затрат на медикаментозное лечение. Это подтверждено в исследованиях ACRN и BASALT. В настоящее время данный тест используют в клинических исследованиях традиционных и новых методов лечения БА [30]. Разработка портативных анализаторов ENO будет способствовать своевременному и быстрому получению результатов тестирования как в условиях стационара, так и на дому [31].

Конденсат паров выдыхаемого воздуха

Анализ конденсата паров выдыхаемого воздуха (КВВ) — атравматичный метод оценки воспаления в дыхательных путях. КВВ накапливается на стенках холодной конденсирующей трубки при попадании на нее теплого воздуха при дыхании. Затем трубку помещают в специальный анализатор, который позволяет одновременно определять содержание летучих и нелетучих медиаторов воспаления в конденсате. Данный тест отражает изменения, происходящие при воспалении в жидкости, выстилающей дыхательные пути.

Этот тест легковыполним и может использоваться у детей и в офисных условиях без дополнительного обучения. В настоящий момент методика не стандартизирована и является предметом дальнейшего изучения. Под влиянием курения, употребления алкоголя, после физических нагрузок, при загрязнении носовой или ротовой полости, изменении температуры и влажности результаты исследования КВВ могут варьировать [32, 33–35]. Зависимости от возраста, пола, циркадного ритма и наличия инфекции не обнаружено.

Основными маркерами, определяемыми с помощью этого метода, при БА являются аденозин [36], маркер оксидантного стресса — перекись водорода [37], изопростан [38], NO [39], pH [40], аммиак, простаноиды и лейкотриены [41–43]. У больных БА в КВВ величина pH снижена и коррелирует с эозинофилией мокроты, уровнем общих нитратов/нитритов и показателями оксидантного стресса. Метод обладает хорошей воспроизводимостью (ВКК 0,97). Показатели не зависят от времени года и не отражают клинический статус пациента [40]. Маркерами КВВ, коррелирующими с тяжестью состояния и/или отражающими ответ на терапию, являются перекись водорода, лейкотриены [44], 8-изопростан, нитраты и нитриты [45]. Концентрации некоторых известных медиаторов в КВВ настолько малы, что для их определения требуются специальные высокочувствительные методы обработки, что ограничивает применимость теста. Маркеры КВВ не коррелируют с таковыми в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) [46].

Будущие исследования должны быть посвящены стандартизации процедур накопления КВВ, ратификации чувствительности анализа и установлению референтных уровней [47, 48]. Легкость проведения теста делает его полезным в протеомике и метаболомике для идентификации новых биомаркеров, изучения фенотипа заболевания и поиска новых подходов к лечению БА.

Исследование мокроты

Индукция мокроты — относительно атравматичный метод сбора образцов содержимого дыхательных путей. Он легко применим в клинических условиях.

Клетки мокроты. Клеточный состав мокроты у больных БА не одинаков. Установлено, что эозинофилия в мокроте является маркером тяжести этого заболевания и чувствительности к глюкокортикостероидам (ГКС). У пациентов с эозинофилией в мокроте наблюдается уплотнение альвеолярно-капиллярных мембран, положительная реакция на терапию ГКС [49, 50] и отсутствие корреляции с гиперреактивностью дыхательных путей [51]. Green [52] и Jayaram [53] по результатам своих исследований сообщают, что в отличие от стандартного лечения при подавлении эозинофилии в мокроте уменьшается частота обострений и необходимость назначения гормонов в высоких дозах. Исходя из этого, можно предположить, что эозинофилия в мокроте является показателем неадекватного лечения воспаления в дыхательных путях и увеличенного риска повторного обострения.

Mehta [55] изучал синусит как фактор, способный повлиять на результаты исследования и лечения. У 201 пациента с БА были исследованы околоносовые пазухи с помощью компьютерной томографии (КТ) и произведен подсчет эозинофилов в мокроте. Тяжесть синусита, подтвержденного КТ-исследованием, коррелировала с количеством эозинофилов как в мокроте, так и в периферической крови, что свидетельствует о связи синусита с маркерами системного воспаления.

Супернатант мокроты. Многие потенциальные биомаркеры были исследованы в супернатанте индуцированной мокроты. Установлено, что уровни урокиназного активатора плазминогена и ингибитора активатора плазминогена [58] при БА, в отличие от контроля, повышены, а содержание нейрокинина А [59] заметно увеличивается при обострении заболевания. Эти маркеры широкого распространения не получили. Вопреки ожиданиям, не обнаружено возрастания концентрации 8-изопростана при недавно диагностированной БА [38]. Saha и соавторы [60] измеряли содержание IL-13 в мокроте и в эндобронхиальных биоптатах. Несмотря на то что при БА IL-13 в мокроте определяются чаще, чем в контрольных группах, однако они обнаружены лишь у половины обследованных больных БА и не были связаны с тяжестью клинического ее течения. Выдвинуто предположение, что содержание IL-13 в подслизистом слое и связках гладких мышц дыхательных путей увеличивается при тяжелом течении БА, но это должно быть экспериментально подтверждено.

Бронхоальвеолярный лаваж. Технические аспекты получения БАЛ экстенсивно изучались в течение двух десятилетий [61]. Основное преимущество бронхоскопического исследования — восстановление биологических образцов в виде клеточного или растворенного материала в питательных средах, взятых из мелких дыхательных путей и альвеолярных пространств. Документально зафиксирована хорошая переносимость этой процедуры при БА с течением от умеренно тяжелого до тяжелого [22 , 62, 63]. БАЛ позволяет идентифицировать широкий диапазон медиаторов, характеризующих патофизиологию БА (IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, фактор некроза опухоли альфа, молекулы межклеточной адгезии-1) [64].

Из-за отсутствия единых стандартов возникают трудности в интерпретации результатов, полученных в разных клиниках и лабораториях, — нередки случаи вариации показателей у одного больного, что уменьшает ценность данного метода. Осложнения при проведении БАЛ встречаются редко.

Исследования жидкости БАЛ у пациентов со стабильной умеренно тяжелой БА и у здоровых добровольцев не обнаружили статистически значимой разницы в клеточном ее составе. Однако есть предположения, что у больных количество эозинофилов выше. При БА умеренной тяжести без лечения стероидами эозинофилия в жидкости БАЛ была более выражена. Замечено также, что при БА, резистентной к стероидам, преобладал фенотип нейтрофильных гранулоцитов [22]. Изучение характеристик клеточного состава и медиаторов в дыхательных путях с помощью БАЛ не обнаружило корреляции с тяжестью течения БА. Ограничением для применения этой процедуры является ее инвазивность.

Щеточная биопсия. Эта процедура позволяет получить свежие эпителиоциты, что невозможно при БАЛ или традиционной биопсии. При изучении полученных клеточных образцов доказано участие эпителиальных клеток в патогенезе БА и их изменение в ответ на бронхолитическую терапию. Бронхиальные эпителиоциты формируют первую линию защиты в дыхательных путях и являются связующим звеном между внешним пространством и воспалительными клетками. Они играют ключевую роль в патогенезе сенсибилизации к аллергенам и вирусных инфекций, связанных с БА [65]. Эпителиоциты при БА имеют характерные признаки: измененный цитокератиновый профиль, увеличенное высвобождение противовоспалительных медиаторов (IL-6, PGE2, EGF, 15-HETE), более короткое время удвоения, повышенные секрецию слизи и чувствительность к апоптозу [66]. У пациентов, принимающих стероиды, эпителиальные метахроматические клетки отражают клиническую тяжесть патологического процесса [67]. Бронхиальные эпителиоциты являются потенциальным источником NO и, таким образом, играют важную роль в процессе воспаления в дыхательных путях [68]. Повреждение эпителиоцитов и последующий процесс репарации активизируют миофибробласты базальной пластинки, что приводит к каскаду событий, заканчивающихся гиперреактивностью дыхательных путей и ремоделированием [69].

В исследованиях отмечена безопасность процедуры получения эпителиоцитов. В зависимости от материального обеспечения технологии этой процедуры жизнеспособность полученных образцов может варьировать. Культура эпителиоцитов — модель для изучения различных механизмов in vitro. Однако результаты этих экспериментов нужно интерпретировать с осторожностью, потому что система in vitro значительно отличается клеточными реакциями и стимулами от таковых in vivo из-за недостатка нейрогуморальных обратных связей и связей с другими тканями.

Бронхиальная биопсия. С помощью данного метода можно получить информацию о морфологии различных анатомических структур дыхательных путей, таких как эпителий, базальная мембрана, подслизистая оболочка и гладкие мышцы. Поэтому его считают «золотым стандартом» для оценки воспаления в дыхательных путях. Полученные образцы тканей исследуют с использованием обычной и электронной микроскопии, иммуногистохимического метода окрашивания, флюоресценции, гибридизации, полимеразной цепной реакции для определения экспрессии мРНК цитокинов и молекул адгезии.

У здоровых людей эпителий интактный, отсутствуют инфильтраты в подслизистом слое. При бронхиальной биопсии у больных БА обнаруживают десквамацию эпителия, гиперплазию бокаловидных клеток, утолщение базальной пластинки, эозинофильные и лимфоцитарные инфильтраты в подслизистой оболочке. Утолщение базальной мембраны вследствие увеличенного депонирования коллагена в ретикулярном слое и пролиферация миофибробластов — признаки ремоделирования дыхательных путей, приводящего к стойкой обструкции [70]. В дыхательных путях при БА увеличиваются грануляция тучных клеток и афинность клеточных рецепторов IgE [71]. Использование стероидов и других противовоспалительных средств сопровождается уменьшением инфильтрации эозинофилами и Th-лимфоцитами собственной пластинки эпителиальной оболочки [72]. Также увеличивается экспрессия IL-4, IL-5, эндотелина, эотоксина и ICAM-1. При исследовании биоптатов бронхов больных с тяжелой БА идентифицировано усиление экспресии IL-8, IL-5, IFN-g и эотоксина и уменьшение экспрессии IL-4, чего не наблюдалось у пациентов с умеренным течением болезни [73]. Изменения воспалительных медиаторов и клеточного профиля предшествуют клиническому ухудшению, что подчеркивает актуальность мониторинга биомаркеров. У пациентов со сниженным значением отношения ФЖЕЛ/ОФВ₁ наблюдалась более плотная базальная мембрана, что свидетельствует о ремоделировании дыхательных путей.

Изучение воспаления с использованием бронхиальных биоптатов может быть ограничено естественной анатомической вариабельностью, очаговым фокальным воспалением, размером образца, их количеством и квантификацией клеточного инфильтрата. Данная методика может быть усовершенствована в ходе дальнейших исследований.

Новый аналитический подход

В результате проведенного анализа сильных сторон, ограничений и интерпретации биомаркеров воспаления в дыхательных путях при БА сделаны выводы о том, что отдельные показатели, имеющие выраженную чувствительность, специфичность и в определенной степени прогностическую ценность, могут быть использованы в качестве инструментов для совокупности больных, но не в целях индивидуального фенотипирования или прогнозирования реакции на лечение. С учетом сложного патогенеза и синдромной природы БА, не удивительно, что нет единого универсального биомаркера. Новая стратегия заключается в использовании комбинированного анализа и биоинформационных методик в целях извлечения необходимой информации из большого объема данных, отдельные составляющие которого могут быть недостаточно информативными. Авторы провели исследование по изучению биомаркеров воспаления в дыхательных путях (цитокины в жидкости БАЛ) у пациентов с тяжелой БА и сравнили их с таковыми при умеренном течении заболевания. Групповой анализ позволил выделить четыре молекулярных фенотипа, один из которых наиболее соответствовал тяжелому течению БА. Три остальных фенотипа помогают различить больных с БА, имеющей сходное клиническое течение [74]. Кроме того, данный подход дает возможность получить сведения о гиперреактивности, эозинофилии дыхательных путей, а также других важных характеристиках, используемых для прогнозирования. Следовательно, этот подход может широко применяться для извлечения необходимой информации из большого объема собранных данных.