Оценка двух механизмов гибели бактериальных культур Pseudomonas aeruginosa под воздействием тобрамицина с помощью модели, разработанной на основе предполагаемых механизмов действия препарата

Бактериальная резистентность представляет собой одну из наиболее серьезных угроз для здоровья человека во всем мире. Многие бактериальные изоляты устойчивы ко всем антибиотикам в монотерапии. Аминогликозиды часто используются в комбинированной терапии при тяжелых инфекциях с множественной лекарственной устойчивостью бактерий. Однако модели, позволяющие количественно оценить различные антибактериальные эффекты аминогликозидов, не разработаны.

В то время как механизм действия аминогликозидов на синтез белков микроорганизмов активно изучается, их разрушающее действие на внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий остается слабо охарактеризованным. J.B. Bulitta и соавторами разработана новая модель для количественной оценки этих двух механизмов действия аминогликозидов, фенотипической толерантности при высоких плотностях бактериальных культур, а также адаптивной бактериальной резистентности при действии аминогликозида тобрамицина на три штамма Pseudomonas aeruginosa. При низких и промежуточных концентрациях тобрамицина (< 4 мг/л) бактерии погибали в основном из-за воздействия на синтез белка, в то время как при более высоких концентрациях (≥ 8 мг/л) преобладающим механизмом уничтожения бактерий было разрушение внешней мембраны. Масштабы гибели были сопоставимы для всех посевов; тем не менее, скорость гибели и роста бактерий были значительно ниже при плотности посева 10^8,9 КОЕ/мл, чем при более низкой. При концентрациях тобрамицина от 1 до 4 мг/л для штамма PAO1-RH задержка гибели составляла от 0,5 до 6 часов – время, предположительно необходимое для синтеза гипотетического летального белка (белков). Разрушение внешней бактериальной мембраны при действии тобрамицина может иметь решающее значение для повышения проникновения к сайтам-мишеням антибиотиков, используемых в синергетических комбинациях с аминогликозидами, и тем самым для преодоления множественной лекарственной резистентности бактерий. Эти два механизма действия аминогликозидов и новая модель количественной оценки весьма перспективны для рациональной разработки схем дозирования новационных синергетических комбинаций аминогликозидов.

В работе были использованы генетически охарактеризованные бактериальные штаммы клинического изолята P. aeruginosa, PAO1 (PAO1-RH). Для оценки штамма с более низкой внутриклеточной концентрацией тобрамицина (вследствие избыточной экспрессии эффлюксного насоса MexXY-OprM) использовали изогенную пару дикого типа P. aeruginosa PAO1 (PAO1-AO) и его mexZ-мутант (PAO1-ΔMexZ).

Известно, что аминогликозидам – важной части арсенала антибиотиков – присущи несколько механизмов действия. Разрушение внешней мембраны грамотрицательных бактерий аминогликозидами может быть особенно важным для разработки синергетических комбинаций препаратов, так как внешняя мембрана представляет собой серьезный барьер для проникновения многих антибиотиков. Этот синергический эффект, по-видимому, определяется внеклеточной концентрацией тобрамицина на внешней мембране и в силу этого не зависит от механизмов резистентности, направленных на уменьшение внутриклеточной концентрации тобрамицина. Воздействие аминогликозидов на внешнюю мембрану было оценено лишь в некоторых исследованиях, и фармакодинамические модели с множественными механизмами бактерицидности, обусловленной аминогликозидами, отсутствуют.

Исследователи предложили первую фармакодинамическую модель для аминогликозидов, которая учитывает два механизма бактерицидности, а также предсуществующую и адаптивную резистентность, и описывает определение количества жизнеспособных микроорганизмов для множественных начальных культур. Предлагаемая модель механизмов действия тобрамицина на P. aeruginosa включает чувствительные, с промежуточной чувствительностью и устойчивые популяции. Отсроченное бактерицидное действие обусловлено влиянием тобрамицина на синтез белка, а немедленное – разрушением внешней мембраны. Соответственно, в отношении всех трех исследованных штаммов для отсроченной гибели бактерий требовались более низкие внутриклеточные концентрации тобрамицина, чем необходимая для непосредственного бактерицидного эффекта вследствие разрушения внешней мембраны (соответствующие концентрации гентамицина, необходимой для разрушения внешней мембраны P. aeruginosa в присутствии ионов Mg²⁺ и Ca²⁺ и вытеснения меченного дансилом полимиксина В, связанного с липополисахаридами P. aeruginosa).

Большой интерес представляет фаза задержки (lag time) – до 6 часов, предшествующая снижению количества жизнеспособных микроорганизмов (штамм PAO1-RH). Такие задержки последовательно наблюдались в дублированных экспериментах с различными концентрациями тобрамицина. Маловероятно, чтобы такие значительные задержки объяснялись тем, что это время необходимо для проникновения к внутриклеточному сайту-мишени. Предложенная модель объясняет эти периоды задержки наличием отсроченного и немедленного механизмов уничтожения бактерий. Задержку, связанную с отсроченной гибелью, можно объяснить тем, что время, необходимое для синтеза гипотетического летального белка (белков), составляет около 2 часов при низкой бактериальной плотности и больше – при высокой плотности. Было показано, что аминогликозиды вызывают ошибки считывания на рибосомах, а включение образовавшихся при этом «неправильных» белков во внутреннюю мембрану дестабилизирует ее и в конечном итоге способствует гибели бактерий.

Поскольку при высоких концентрациях тобрамицина наблюдали быструю гибель бактерий (без фазы задержки), модель предполагает, что немедленная гибель обусловлена разрушающим воздействием тобрамицина на внешнюю мембрану. Она была наиболее выраженной в отношении восприимчивых популяций и популяций с промежуточной чувствительностью, но практически не наблюдалась в отношении резистентной популяции, что согласуется с опубликованными данными о фенотипическом снижении суммарного отрицательного заряда на внешней мембране тобрамицин-резистентных грамотрицательных бактерий. Обобщение этих результатов свидетельствует, что тобрамицин способен перме­абилизировать (делать проницаемой) внешнюю оболочку бактерий восприимчивой популяции и популяции с  промежуточной чувствительностью, но не тобрамицин-резистентной. Последняя была относительно небольшой, со смоделированной частотой мутаций 5,83-6,43 log₁₀ в зависимости от штамма, что согласуется с наблюдаемым анализом профилей популяции. Для уничтожения этой популяции необходимо воздействие иммунной системы или второго антибиотика, используемого в комбинированной терапии.

Были проанализированы два штамма дикого типа P. aeruginosa и мутантный штамм ΔmexZ; тобрамицин-резистентные изоляты не изучали, что представляет собой потенциальное ограничение данного исследования. Авторы отмечают необходимость проведения исследований различных аминогликозид-резистентных штаммов для количественной оценки относительного вклада немедленного и отсроченного уничтожения бактерий резистентных штаммов и для определения масштабов и временной динамики синергии при использовании комбинаций аминогликозидов. В предыдущих исследованиях с использованием модели распространения инфекции в биореакторе с полыми волокнами и модели пневмонии у мышей был оценен синергический эффект действия комбинаций аминогликозидов и β-лактамов на аминогликозид-восприимчивые штаммы P. aeruginosa и аминогликозид-устойчивые штаммы Acinetobacter baumannii. Однако количественные модели временной динамики, которые позволяют предсказывать синергию при использовании комбинированных схем на основе аминогликозидов, используются редко. Результаты, полученные для мутантного штамма ΔmexZ и его изогенного штамма дикого типа PAO1, позволяют предполагать, что отсроченная гибель менее важна для устойчивых штаммов со сниженной внутриклеточной концентрацией аминогликозидов.

В дополнение к генотипической резистентности, представленной тремя бактериальными популяциями с различной чувствительностью, предлагаемая модель включала два фенотипических механизма толерантности, а именно избыточную экспрессию эффлюксного насоса MexXY-OprM и замедление гибели при высокой бактериальной плотности по сравнению с таковой при низкой плотности (так называемый эффект влияния бактериальной культуры). Немедленное уничтожение может быть полностью подавлено, а скорость отсроченного – снижена в 82 раза (для штамма PAO1-RH) или до 34 раз (для остальных штаммов) при высокой бактериальной плотности по сравнению с низкой. Скорость бактериальной репликации и синтеза белка была также значительно меньшей при высокой плотности посева, чем при низкой. Таким образом, эффект влияния бактериальной культуры уменьшал скорость, но не степень вызываемой тобрамицином гибели микроорганизмов при высокой бактериальной плотности. Используемая ранее модель включала большую (> 50% от общего посевного материала) популяцию E. coli с высокой плотностью, резистентную к гентамицину. Однако полученные авторами данные для P. aeruginosa показали, что тобрамицин в клинически достижимых концентрациях 4-16 мг/л позволяет достичь показателей гибели бактерий 3,5 и 5,2 log₁₀ даже для посева с самой высокой плотностью 10^8,9 КОЕ/мл, что говорит об отсутствии больших тобрамицин-резистентных популяций P. aeruginosa.

Ранее уже сообщалось, что адаптивная резистентность (то есть толерантность) P. aeruginosa к аминогликозидам связана с гиперэкспрессией компонента MexY эффлюксной помпы MexXY-OprM. В ответ на действие тобрамицина в пределах приблизительно 2 часов повышалось содержание как ингибирующих макрофаги цитокинов, так и белка MexY в клетках P. aeruginosa. После удаления тобрамицина требовалось от 6 до 24 часов для прекращения суперэкспрессии и возвращения к исходному уровню. Это быстрое начало и медленное снижение адаптивного сопротивления лучше всего описывается двухкомпонентной моделью. Оценка констант скорости при адаптивной резистентности показала продолжительность периодов полужизни – 0,5 и 18 часов – двух экспоненциальных фаз адаптивной модели резистентности для PAO1-RH. Картина быстрого начала и медленного снижения адаптивной резистентности согласовывалась с ранее опубликованными данными.

При клинически значимых концентрациях тобрамицина адаптивная резистентность уменьшала смоделированную внутриклеточную экспозицию тобрамицина (AUC¹_внутр) приблизительно до половины экспозиции в плазме (AUC_плазма). Адаптивная резистентность проявлялась значительно быстрее при режимах дозирования каждые 24 часа по сравнению с дозированием каждые 8 часов. Однако при той же суточной дозе дозирование каждые 24 часа позволяло достичь в 2 log₁₀ большей гибели бактерий, чем при дозировании каждые 8 часов благодаря большему воздействию препарата в течение первых 12 часов – когда наиболее жизнеспособные бактерии представляли восприимчивую популяцию или популяцию с промежуточной чувствительностью.

¹ AUC – площадь под кривой зависимости концентрации от времени с момента времени 0 до времени достижения последней концентрации, поддающейся количественному определению.

Были определены профили зависимости воздействия тобрамицина от времени, а также наличие отсроченной и немедленной функции уничтожения бактерий с помощью моделирования на основе предполагаемого механизма действия препарата. Ограничением исследования является отсутствие прямых экспериментальных доказательств немедленной гибели, связанной с действием тобрамицина на внешнюю мембрану. Однако в ряде исследований было продемонстрировано влияние тобрамицина на внешнюю мембрану P. aeruginosa и показано, что этот внеклеточный эффект вызывал повышение гибели P. aeruginosa более чем в 3 log₁₀. Кроме того, концентрации тобрамицина, необходимые для немедленной гибели в рамках использованной модели, находились, по сообщениям, в том же диапазоне, что и необходимые для воздействия аминогликозидов на внешнюю мембрану P. aeruginosa, что подтверждает правдоподобность предложенной модели.

Исследование показало, что тобрамицин убивает P. aeruginosa посредством двух механизмов. Внеклеточная высокая концентрация тобрамицина обусловливала непосредственную быструю гибель, тогда как внутриклеточная концентрация в условиях модели вызвала замедленную гибель бактерий. Непосредственный механизм уничтожения, скорее всего, не зависит от подавляющего большинства механизмов резистентности, которые лишь уменьшают внутриклеточную концентрацию тобрамицина. Скорость уничтожения бактерий существенно снижалась при высокой плотности бактериального посева (по сравнению с низкой). Тем не менее, масштабы гибели были сопоставимы для всех посевов. При разработке предложенной модели, основанной на предполагаемом механизме действия, впервые учитывались два возможных механизма действия, а также обусловленная генотипом и фенотипом устойчивость к аминогликозидам. Авторы отмечают, что для оценки двух механизмов уничтожения бактерий в штаммах с различными механизмами резистентности к аминогликозидам необходимы дальнейшие исследования.

Предложенные механизмы действия аминогликозидов и количественная модель весьма перспективны для рационального развития и оптимизации новационных синергетических комбинаций с аминогликозидами и режимов дозирования, позволяющих преодолевать множественную лекарственную устойчивость грамотрицательных бактерий.

Реферативный обзор подготовила Наталия Купко по материалам Bulitta J.B., Ly N.S., Landersdorfer C.B. Two mechanisms of killing of  pseudomonas aeruginosa by tobramycin assessed at multiple inocula via mechanism-based modeling. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2015; 59 (4): 2315-2327.